Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой широко используемую методику быстрого создания множества копий образцов ДНК для их дальнейшего детального изучения. ПЦР имеет важное для большинства генетических исследований, и является одним из самых распространенных методов генетических (анализ образцов ДНК, идентификация инфекционных агентов, клонирование генов, введение мутаций, выделение новых генов) и лабораторных медицинских (диагностика заболеваний (наследственных и инфекционных) исследований и криминалистике (установление отцовства).

Большинство методов ПЦР основаны на термическом циклировании. В ходе термических циклов реагенты подвергаются повторяющимся циклам нагрева и охлаждения, чтобы обеспечить реакции плавления и ферментативной репликации ДНК. ПЦР использует два основных реагента праймеры (короткие одноцепочечные фрагменты ДНК, известные как олигонуклеотиды, которые являются комплементарной последовательностью к целевому участку ДНК) и ДНК-полимеразу.

Проведение ПЦР

ПЦР-тест проводится с помощью амплификатора, который обеспечивает охлаждение и нагревание емкостей (пробирок) с образцами с точностью в 0,1°C. В пробирки с образцами может быть добавлено масло с высокой температурой кипения, которое помогает избежать испарения реакционной смеси, а также специфические ферменты с целью увеличить выход ПЦР-реакции. Простейший набор компонентов для проведения ПЦР включает:

  • ДНК-матрицу с участком амплифицироваемой ДНК;
  • праймеры, комплементарные концам нужных фрагментов ДНК;
  • термостабильную ДНК-полимераза;
  • дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
  • ионы Mg2+, которые обеспечивают работу полимеразы;
  • буферный раствор.

Точность ПЦР анализа напрямую зависит от соблюдения технологии. На странице сайта производителя ПЦР тестов https://biocor-tech.com/ru/blog/plr-covid-19 вы можете ознакомиться с типичными ошибками при выполнении ПЦР исследования.

Преимущества ПЦР-тестирования

  • Выявление специфических патогенов, которые трудно культивировать in vitro и которые требуют длительного периода культивации;
  • Ускоренная диагностика бактериемии, особенно при низком уровне бактерий в образцах;
  • Выявление патогенов во внелегочных образцах, которые моли быть пропущены мазками и культурами;
  • Важное дополнение для некоторых диагностических тестов, которые по-прежнему полагаются на мазки и культуры (в частности, туберкулез).

Специфичность и применение

На первом этапе ПЦР две нити двойной спирали ДНК физически разделяются при высокой температуре (денатурация нуклеиновых кислот). На втором этапе температура понижается, и праймеры связываются с комплементарными последовательностями ДНК. Затем две нити ДНК становятся шаблонами для ДНК-полимеразы, чтобы ферментативно собрать новую нить ДНК из свободных нуклеотидов, строительных блоков ДНК. По мере развития ПЦР генерируемая ДНК сама используется в качестве шаблона для репликации, приводя в движение цепную реакцию, в которой исходный шаблон ДНК экспоненциально амплифицируется.

ПЦР имеет ряд ограничений, которые затрудняют его использование в массовом масштабе. Во-первых, некоторые материалы, необходимые для тестирования (реактивы, носовые тампоны, транспортные среды и т. д.) могут быть доступны лишь в ограниченном количестве. Во-вторых, даже если ПЦР способен выдавать результаты в течение нескольких часов, сложная логистика сбора образцов, их транспортировки в лабораторию, анализа и получения результатов приводит к длительному ожиданию результатов.

Это затрудняет ПЦР-тестирование большого числа людей, которые находятся в изоляции. Наконец, относительно высокая стоимость ПЦР является сдерживающим фактором в некоторых странах.

Интерпретация результатов

Отрицательный результат ПЦР-теста указывает на отсутствие признаков специфических ДНК или РНК в исследуемом образце. В случае, если не выявлена другая этиология, а подозрение на присутствие специфической инфекции сохраняется, следует собрать и протестировать дополнительные образцы.

Положительный результат указывает на присутствие в организме специфических ДНК или РНК и подтверждает инфекцию, но не обязательно указывает на наличие жизнеспособного исследуемого организма или на заразность пациента.

Читайте також ❯❯❯